碧云天研发的SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法) (SignalUp™ Ultra Sensitive ELISA Assay Kit with Fluorescent HRP Substrate)是基于在辣根过氧化物酶(HRP)存在的条件下，过氧化物酶荧光底物ADHP与H2O2反应生成试卤灵(Resorufin)，从而对ELISA反应体系中的HRP进行增强型超敏荧光检测的试剂盒。

本试剂盒优化了相应的增敏试剂，在ELISA应用中检测HRP灵敏度比碧云天的同类产品SignalUp™ ELISA超敏检测试剂盒(P0205)高约2-5倍，比常规TMB作为底物时提高20-50倍以上，这样可以大大减少珍贵样品的用量，并有可能检测一些因浓度过低而不能被常规显色方法检测的样品。在ELISA检测时，如果样品非常珍贵，或者待测目标分子因为浓度过低而不太容易被检测到时，强烈推荐使用本试剂盒。本产品和Thermo的QuantaRed™ Enhanced Chemifluorescent HRP Substrate相近。

常见的用于ELISA测定中检测HRP活性的底物多为显色底物，如TMB、OPD和ABTS等，需要进行吸光度的检测。这些底物的性能如检测灵敏度、动态范围等的差别较大。其中，TMB是目前最灵敏的显色底物之一，较其它几种显色底物有更好的检测灵敏度，并在ELISA检测中广泛应用[1]。但吸光度检测法无法对超过四个光学密度单位(Optical density, OD)进行准确定量，限制了ELISA检测的上限，而荧光法则不受影响，在检测仪器允许的情况下能够准确检测极高的荧光强度。更为重要的是，相对于吸光度检测法，荧光检测法更为灵敏，检测限范围也更宽[2]。

ADHP，即10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine，又名Amplex Red、Ampliflu™ Red、OxiRed Probe、Amplisyn Red或A6550，中文名为荧光红染料或10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪，CAS号为119171-73-2，是一种可以用于吸光度或荧光检测的过氧化物酶底物，更常用于荧光分析检测。ADHP是目前已知的用于辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)和过氧化氢(H2O2)的检测最灵敏、最稳定的荧光探针之一。在HRP存在的情况下，ADHP与H2O2以1:1的化学定量比反应，生成高荧光的试卤灵(Resorufin)，其最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，并且在激发波长处有很强的可见光吸收，也可在A570检测吸光度[3]。在免疫学分析中，ADHP已经广泛地用来检测HRP。与其它商品化的HRP底物相比，如二氢荧光素和二氢罗丹明等， ADHP的本底荧光水平更低，受空气氧化的影响也较小。本试剂盒所使用的增敏试剂，可以有效增强ADHP的荧光，从而进一步提高荧光检测的灵敏度。本试剂盒的检测原理请参考图1。

图1.碧云天SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法)的检测原理图。图A为ADHP在HRP催化下生成试卤灵的反应。图B为试卤灵在pH为7.4的缓冲溶液中的吸收和发射光谱。Abs.: Absorption, 吸收; Em.: Emission, 发射。

本试剂盒检测背景低。反应生成的试卤灵的发射波长接近红光区(见图1B发射光谱)，此波长下生物样品自发荧光(位于波长较短的蓝绿光区)的干扰较小，使ADHP成为对生物样品中目标分子进行检测的理想底物。

本试剂盒检测范围广，灵敏度极高。本试剂盒显著提升了普通ELISA实验的检测范围，灵敏度远远高于TMB底物，比碧云天的同类产品SignalUp™ ELISA超敏检测试剂盒(P0205)高约2-5倍。本试剂盒与P0205以及TMB检测信号对比参考图2。

图2.碧云天SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法)与碧云天同类产品SignalUp™ ELISA超敏检测试剂盒以及TMB法对96孔板中包被的不同浓度生物素标记二抗(Biotin-Ab)检测效果对比图。生物素标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0286)稀释至图中所示各浓度，对96孔板进行包被；辣根过氧化物酶标记Streptavidin (A0303)用PBS按1:10,000稀释后加入各反应孔中室温孵育30分钟；洗板后，分别加入100µl ADHP工作液(本试剂盒或P0205)或TMB显色液(ELISA HRP显色用) (P0209)，室温避光孵育10分钟。对使用本试剂盒和P0205试剂盒工作液的反应孔进行荧光检测，激发和发射波长分别设置为558nm和590nm；对TMB反应孔中加入TMB显色终止液(450nm, 不含硫酸) (P0215)并在450nm检测吸光度。图A为使用各方法检测的标准曲线，生物素标记二抗浓度为横坐标，荧光强度(本试剂盒和P0205，左纵轴)或A450 (TMB, 右纵轴)为纵坐标。对曲线分别进行ELISA中常用到的四参数拟合(Four Parameter Logistic Regression, 4PL)，并用空白缓冲液信号均值加上三倍标准偏差对检测限(Limit of detection, LOD)进行计算，得出P0205检测限相比TMB显色体系提升约10倍，而本试剂盒比P0205的检测限进一步提高约4.5倍。图B为三种方法在各浓度的信号与背景信号比值，从图中可以看出荧光检测不受信号读取上限的限制，极大增加了信号-背景比(Signal-to-Background ratio, S/B ratio)，而本试剂盒比P0205在相同浓度下的信号-背景比又有进一步的提升，可使检测灵敏度得到提高。实测数据会因试剂、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒组分齐全，使用便捷。本试剂盒全套提供试剂，包括过氧化物酶底物ADHP (ADHP Substrate Solution)、稳定过氧化物溶液(Stable Peroxide Solution)、增强剂溶液(Enhancer Solution)和终止试剂(Stop Reagent)。用户只需简单混合并使用，无需额外准备缓冲液或溶解试剂。

本试剂盒反应可控。本试剂盒提供的反应终止试剂，可有效终止HRP催化荧光产物的生成，可至少获得1小时的稳定信号。本试剂盒终止液使用效果参考图3。

图3.碧云天SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法)反应终止液的使用效果图。在低(0.0001%)、中(0.002%)、高(0.01%)、极高(0.2%)四种浓度的生物素标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0286)，即图A中的low/medium/high/ultra-high Biotin-Ab，包被的孔中加入1:10,000稀释的辣根过氧化物酶标记Streptavidin (A0303)，室温孵育30分钟；洗板后，分别加入100µl ADHP工作液，室温避光孵育10分钟后，进行同一浓度的生物素包被孔终止反应的平行实验：在反应孔中加入20µl反应终止液，对照孔不做处理；对各孔反应进行荧光检测跟踪，激发和发射波长分别设置为558nm和590nm，反应温度为25℃。图A为空白孔及低、中、高、极高四组生物素标记山羊抗小鼠IgG(H+L)浓度下反应孔荧光强度随时间的变化。图B为反应在终止和未终止情况下持续约1小时后的标准曲线。从图中可以看出，本试剂盒中的反应终止液能够有效终止HRP催化荧光产物的生成。实测数据会因试剂、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。w/o, without。

对于96孔板，按照每孔使用100μl ADHP工作液计算，本试剂盒小包装可以用于100个样品的检测，中包装可以用于500个样品的检测，大包装可以用于2000个样品的检测。

-20℃避光保存，一年有效。4℃避光保存，一个月有效。

Stop Reagent (2X)三个月内使用效果最佳，如果要保存更长时间，须-80度保存，一年有效。

各溶液需平衡至室温(25℃左右)后再使用，溶液温度会影响反应的动力学。

各溶液中均含有空气敏感的组分，暴露时间过长容易失效，使用后，请盖紧瓶盖。

各溶液中均含有光敏组分，使用时注意避光，特别是配制好的ADHP工作液，使用前和使用中需严格避光。

可根据需要对ADHP Substrate Solution (100X)进行分装后保存。

使用过程中，各溶液在吸取过程中必须要更换枪头，否则相互污染后会导致逐渐失效，影响后续的使用效果。

检测时建议使用96孔黑板，例如碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。

Stop Reagent对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。

在HRP浓度过高或反应时间过长时，生成的荧光产物试卤灵可能会因浓度过高而产生自猝灭现象(如图3A中0.2%浓度所示)。可通过调整HRP标记的检测抗体或Streptavidin浓度来优化检测范围。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。